細胞融合的步驟：
1.制備飼養(yǎng)細胞層 一般選擇小鼠腹腔巨噬細胞。
與免疫小鼠相同晶系的小鼠，常用BALB／C小鼠，6～10周齡
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拉頸處死，浸泡在75％乙醇內(nèi)，3～5min
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用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
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用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養(yǎng)液(嚴禁刺破腸管)
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反復沖洗，吸出沖洗液
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沖洗液放人10ml離心管，1 200r／min／分離5～6min
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用20％小牛血清或胎牛血清的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)至lXl0‘／ml
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加入96孔板，100ul/孔
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放人37℃C02孵箱培養(yǎng)
2．制備免疫脾細胞
zui后一次加強免疫3d后小鼠拉頸處死
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無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗1次
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脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)
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離心，細胞用培養(yǎng)液洗2次
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計數(shù)
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取脾淋巴細胞懸液備用
3．制備骨髓瘤細胞
般選用小鼠腹
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取對數(shù)生長期骨髓瘤細胞離心
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用無血清培養(yǎng)液洗2次
4.融合
(1)將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50m1離心管中用無血清不*培養(yǎng)液洗1次，離心，l 200r／min，8min；棄上清液，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。
(2)90s內(nèi)加入37℃預溫的1m1 45％PEG(分子量4 000)溶液，邊加邊輕搖。37℃水浴作用90s。
(3)加37℃預溫的不*培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
(4)離心，800r／rain，6min。
(5)棄上清液，用含20％小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。
(6)將上述細胞，加到已有飼養(yǎng)細胞層的96孑L板內(nèi)，每孔加100tzl。一般1個免疫脾臟可接種4塊96孔板。
(7)將培養(yǎng)板置37℃、5％CO：培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細胞融合是雜交瘤技術的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。然后用培養(yǎng)液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細胞適當稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過程中有3個問題應特別注意，①細胞比例，骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1：2到1：10不等，常用1：4的比例。應保證兩種細胞在融合前都具有較高活性。②反應時間，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1分鐘滴加4。5ml培養(yǎng)液；間隔2rain滴加5ml培養(yǎng)液，然后加培養(yǎng)液50ml。③培養(yǎng)液的成分，良好的培養(yǎng)液對融合細胞尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴格配制。如融合效率降低，應隨時核查培養(yǎng)基情況。
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