細胞凋亡檢測方法在腫瘤研究中的應用
細胞凋亡的細胞化學測定
細胞凋亡的細胞化學測定包括細胞表面（細胞膜）的結構和通透性改變的測定和細胞核DNA改變的測定。根據(jù)應用的范圍，又可分為細胞群休和單個細胞測定兩種，以下僅介紹其中幾種較為常用的方法。
碘化丙啶（propidium iodide,PI）檢測
早期死亡細胞膜通透性狀態(tài)的不同是區(qū)分細胞凋亡和壞死的一個重要指標，凋亡細胞在進入zui終溶解階段前，胞膜通透性無明顯改變，相對分子質量大的與DNA結合的熒光染料（如PI）不能時入凋亡細胞內(nèi)，而相對分子質量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細胞攝取。應用流式細胞儀或熒光顯微鏡可區(qū)分和壞死細胞，細胞內(nèi)DNA出現(xiàn)Hoechest 3342標記而不出現(xiàn)PI標記的為凋亡細胞。
細胞凋亡檢測方法在腫瘤研究中的應用
檢測方法：獲取11×106細胞/ml的細胞懸液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，進行流式細胞儀分析或熒光顯微鏡觀察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外線激發(fā)，前者熒光為紅色（620nm）,后者熒光為藍色（480nm）。正常細胞藍色zui強。早期凋亡細胞由于DNA的漏出藍色稍弱并有少量的紅色熒光，晚期凋亡細胞紅色熒光加強。壞死細胞紅色熒光zui強。
膜聯(lián)蛋白（annexin）V標記
正常細胞的細胞膜磷脂分布是不對稱的，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）位于細胞膜內(nèi)側，在細胞凋亡時轉至細胞膜外表面，這一改變被認為是特導性的，并且可作為凋亡細胞表面改變的標記。PS表面化發(fā)生于凋早期，其機制尚不清，可能是一種導致機體吞噬凋亡細胞的信號。膜聯(lián)蛋白V是Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對PS具有高度親和力，熒光標記的膜聯(lián)蛋白V與細胞表現(xiàn)PS結合，再用顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，可以觀察凋亡過程中細胞膜PS的表面化。結合PI染色進行雙參數(shù)檢測尚能區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞及壞死細胞。正常細胞膜聯(lián)蛋白V（-）PI（-），早期凋亡細胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡細胞和壞死細胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜聯(lián)蛋白V標記僅有不到三分之一的凋亡細胞出現(xiàn)陽性標記，其原因尚不明。同時需注意度的是凋亡后期溶解階段，細胞碎片也可出現(xiàn)明顯的陽性著色。
檢測方法：1×106細胞/ml細胞懸液，先后用膜聯(lián)蛋白V--FITC及PI染色，流式細胞儀分析，獲得由四個象限組成的細胞直方圖（cytogram），每個象限的細胞數(shù)目就是在檢測細胞總數(shù)在所點的組份。左下象限代表正常細胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡細胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡細胞和壞死細胞（An+PI+）,左上象限代表細胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細胞（An-PI+）。用生物素標記膜聯(lián)蛋白V還可以作體內(nèi)試驗。將生物素標記膜聯(lián)蛋白V注射小鼠體內(nèi)，30分鐘后處死，迅速取出要研究的組織置于甲醛內(nèi)固定，然后，常規(guī)石蠟切片，脫蠟、水化，用親和素標記的過氧化物酶程程序孵育，DAB顯色，光鏡下觀察凋亡細胞。
DNA瓊脂凝膠電泳法
細胞凋亡時，在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下，DNA在核小體間被切割成180-200bp整數(shù)倍的單或寡核苷酸片段，在電泳時表現(xiàn)為特征性的“梯形帶”。自Wyllie把內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解產(chǎn)生“梯形帶”與細胞凋亡相以來，“梯形帶”被作為細胞凋亡的一個重要的生化指標。盡管有報道指出，實驗中出現(xiàn)典型的形態(tài)改變時可不伴有核小體間的DNA降解，對這一指標提出質疑，本方法仍被廣泛應用。但此方法敏感性不高，大量凋亡細胞同時存在時才出現(xiàn)典型的結果，且只能被用于細胞群體，不能用于組織的原位檢測。
檢測方法：培養(yǎng)細胞清洗、離心，加入細胞裂解液裂解，高速離心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已錠的1％-2％的瓊脂糖凝膠的樣品的孔中進行電泳，zui后在紫外線燈下觀察和攝影。
DNA裂解的原位檢測
在細胞水平檢測DNA裂解的原位標記技術已越來越多地被用于組織切片和培養(yǎng)細胞，細胞凋亡時，由于DNA的裂解，形成單或寡核小體的雙鏈相對分子質量小的片段及在相對分子質量大的DNA上形成單的繼裂（缺口，nick）。此類斷裂可用生物素、地高辛或熒光素標記的核苷酸在3`-OH端予以顯示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脫氧核苷酸轉移酶（TdT），前者使核苷酸結合于缺口，需要模板存在，標記方法通常被稱為“原位缺口平移”（insitu nick translation,ISNT）,后者使核苷酸在雙鏈的斷端延伸，不需要模板的存在，其方法被稱為未端記（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的應用已很廣泛，其優(yōu)點是可用于原位標記，可用于病理組織，并可進行定量分析。值得注意的是壞死期由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶和蛋白質酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出現(xiàn) 陽性反應。組織或細胞外理不當時可出現(xiàn)假陽性。因而，TUNEL等方法對凋亡細胞的標記是選擇性的。而不是特異性的，TUNEL或其他DNA裂解原位標記的分析應結合陽性細胞的形態(tài)，尤其是核的特征，細胞的分布和有無炎癥反應，除外非凋亡的陽性反應。
檢測方法：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，蛋白質酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，顯色（辣根過氧化物酶標記可用DAB顯色，堿性磷酸酶標可用NBT+BCIP顯色），復染，脫水，封片。凋亡細胞核呈現(xiàn)藍色（NBT+BCIP顯色）或者棕黃色（DAB顯色）。
凋亡蛋白質酶（Caspase）-3及其底物的檢測
凋亡蛋白質酶是一類半胱氨酸蛋白質酶，具有特異性水解底物分子天冬氨酸（Asp）殘七C端肽鍵功能，是近年隨著調(diào)亡研究的深入而發(fā)現(xiàn)的重要凋亡分子。迄今已有13個分子得到命名，分別為凋亡蛋白質酶1-13?；械蛲龅鞍踪|-3是被認為在多種組織、細胞類型中zui常涉及的凋亡效應分子。活化的凋亡蛋白質酶-3僅在凋亡細胞中發(fā)現(xiàn)，因此，檢測凋亡蛋白質酶-3的活性有助于發(fā)現(xiàn)早期的凋亡細胞。一般采用人工合成四肽熒光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白質酶-3在D與AMC之間水解，釋放熒光物質、AMC，后者在紫外線激發(fā)下發(fā)出波長為430-460nm的熒光，通過流式細胞儀或分光光度計對其強度進行定量，從而測定凋亡蛋白質酶-3的活性。由于醛對凋亡蛋白質酶-3的水解活性抑制作用，因此同時加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白質酶-3對DEVD-AMC的水解，不產(chǎn)生熒光。這樣的抑制試驗可作為對照，使凋亡蛋白質酶-3的活性分析更有特異性。但是，上述方法不適用于組只切片，因此有人嘗試采用針對活化的凋亡蛋白質酶-3亞基的抗體，通過免疫組化顯示凋亡細胞，然而其敏感性及特異性尚不能令人滿意。
檢測方法：培養(yǎng)細胞（也可以預先作凋亡誘導并在不同時段收集細胞）在裂解液內(nèi)裂解、離心、去上清液。加入凋亡蛋白質酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同時用不加底物的樣品作對照，流式細胞儀檢測，加有底物的樣品釋放出的熒光強度樣對照樣品明顯增強。如加入DEVD-AMC時再加入DEVD-CHO，樣品釋放的熒光強度與對照樣品無差異。
細胞凋亡檢測方法在腫瘤研究中的應用
凋亡蛋白質酶-3導致細胞凋良心是通過水解或滅活一些細胞關鍵蛋白質實現(xiàn)的，因此檢測凋亡蛋白質酶-3底物的改變也有助于辨認細胞的凋亡。PARP是*個被認識的凋亡蛋白質酶-3底物，它的相對分子質量為116000，水解后形成相對分子質量為85000及相對分子質量為25000的兩個片段，用運載相對分子質量為85000片段的抗體可以觀察細胞是否發(fā)生凋亡。細胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白質酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸殘基形成一個新的抗原表位，用抗此表位的抗體可以在組織切片上辨認凋亡細胞。另外一種細胞骨架蛋白質肌動蛋白（actin）被水解后產(chǎn)生一種稱為“fractin”的片段，在凋亡早期出現(xiàn)，并認為與細胞膜的起泡有關，可能有助于早期凋亡細胞的辨認?？傊?，隨著對凋亡蛋白質酶及其底物的進一步研究，將會發(fā)現(xiàn)更有價值的有助于檢測凋亡細胞的方法。
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