PCR檢測(cè)試劑盒使用時(shí)有哪些地方是需要我們注意的？
PCR檢測(cè)試劑盒利用DNA擴(kuò)增的線(xiàn)性原理，可以測(cè)定樣品中已知序列的絕對(duì)或相對(duì)量。qPCR會(huì)監(jiān)測(cè)每個(gè)PCR循環(huán)中的DNA擴(kuò)增。當(dāng)DNA處于對(duì)數(shù)線(xiàn)性擴(kuò)增階段時(shí)，熒光量相對(duì)于背景增加。熒光積累至可測(cè)的那一點(diǎn)稱(chēng)為閾值循環(huán)(CT)或交叉點(diǎn)。通過(guò)使用已知量的標(biāo)準(zhǔn)DNA的多次稀釋?zhuān)梢援a(chǎn)生對(duì)比CT的對(duì)數(shù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后可以從其CT值計(jì)算未知樣品中DNA或cDNA的量。適用于多色熒光PCR儀。
PCR檢測(cè)試劑盒的使用注意事項(xiàng)：
1.實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按步驟執(zhí)行，不使用檢測(cè)試劑盒提供的組份或不按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)可能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。
2.所有試劑應(yīng)在規(guī)定溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的試劑在使用前應(yīng)充分混勻。試劑盒反復(fù)凍融次數(shù)不宜超過(guò)5次。
3.實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)按照國(guó)家有關(guān)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范執(zhí)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)分區(qū)(試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū))，各區(qū)物品為專(zhuān)用，不得交叉使用，避免污染。
4.操作臺(tái)、移液器、離心機(jī)等儀器用品應(yīng)經(jīng)常用1%次氯酸鈉、75%乙醇或紫外燈進(jìn)行消毒。耗材應(yīng)進(jìn)行無(wú)酶處理。
5.待檢樣本、試劑盒組份及實(shí)驗(yàn)中的廢棄物需按照具有潛在傳染性物質(zhì)處理方法進(jìn)行處理。
6.為防止熒光干擾，應(yīng)避免使用含熒光物質(zhì)的手套，避免用手直接接觸，預(yù)防交叉污染。
7.檢測(cè)結(jié)果為陰性，并不*代表為非感染狀態(tài)，具體診斷需結(jié)合獸醫(yī)臨床。
8.產(chǎn)生假陰性的可能原因?yàn)椋捍龣z樣本在采集、運(yùn)輸、保存及核酸提取過(guò)程中操作不當(dāng)造成DNA降解；樣本中核酸濃度低于z低檢測(cè)限；病毒待測(cè)靶基因出現(xiàn)變異；未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾因素。
9.產(chǎn)生假陽(yáng)性的可能原因?yàn)椋捍龣z樣本采集、運(yùn)輸及核酸提取過(guò)程中發(fā)生交叉污染。
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